作为最知名的新一代基因编辑工具，CRISPRCas 技术具有高效率，高精度的特点，并已经广泛应用于医学、农业等多个领域。和其他生物系统一样，CRISPRCas 系统的 Cas 蛋白也具有显著的序列多样性。由于 Cas9 和 Cas12a 在真核细胞中表现出强大的核酸酶活性，它们被广泛用作多功能的基因组工程工具。然而 Cas9 和 Cas12a 的大分子量性质（大于 1000 个氨基酸）AAV 等常见的基因治疗载体递送效率，限制了 CRISPRCas 技术在基因治疗中的应用。因此，亟待寻找更小的的 Cas 核酸酶来解决这一问题。
诺贝尔化学奖获得者 Jennifer Doudna 于 2018 年发现了一种 V-F 型 Cas12f 核酸酶（旧称 Cas14），这一类 Cas 核酸酶的大小仅有 400700 氨基酸，远远小于 Cas9 和 Cas12a。随后 Karvelis 等人表明 Cas12f 核酸酶能够在体外以 pam 依赖的方式靶向切割 dsDNA。这些研究说明 Cas12f 效应子在基因编辑中的应用潜力和优势，以及成为基因组编辑工具的可能性。
图 | 相关论文（来源：Nature Chemical Biology）
近期，来自上海科技大学的季泉江教授研究团队系统地描述了一种微型 V-F 效应蛋白 AsCas12f1 的生化特性以及潜在的应用，并在Nature Chemical Biology期刊发表了题为：Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease 的研究论文。
该报道发现了一种来自嗜热菌 AsCas12f1 的微型核酸酶 AsCas12f1，以及其靶向 dsDNA 识别和切割机制，并验证分析其在细菌和人体中的基因编辑作用。
通常来说，CRISPRCas 反应过程包含三个阶段：获取并整合外源基因(adaptation), 转录 CRISPR 序列(expression)，以及剪切靶基因 (interference)。
adaptation。
在普遍的 CRIPPR-Cas 系统中，对 PAM 的特异性识别是 Cas 核酸酶靶向剪切 dsDNA 的前提。因此，论文作者首先验证 CRISPR-AsCas12f1 对 PAM（protospacer-adjacent motif）具有特异性识别作用，他们利用一个含有大量随机PAM序列的质粒库来转化具有 CRISPR-AsCas12f1 system 表达能力的大肠杆菌，通过高通量测序技术发现 AsCas12f1 对PAMs 的 5′-NTTR 位点具有最高的识别效率。紧接着使用 small RNA-seq 技术检测到 45-48nt 大小的成熟 crRNA 以及 38144-nt 的 tracrRNA 表达。尺寸排除色法（ analytical size-exclusion chromatography (SEC)）检测到 AsCas12f1 和 crRNA ，tracrRNA 构成一个 RNP 复合物。AsCas12f1 通过在 PAM 近端段创建一个大约 11nt 长的 5‘TS 悬垂和 pam- 远端节段的一个近钝端来不对称切割 dsDNA
除了 dsDNA 的裂解活性外，大多数 Cas12 核酸酶还具有 ssDNA 的裂解能力。AsCas12f1 也以 PAM 独立的方式切割 ssDNA 底物，其 DNA 断裂位点与 dsDNA 的断裂位点相同。AsCas12f1 还通过核苷酸将 PAM 远端游离 ssDNA 端从 3 ‘裁剪到 5’ 核苷酸，产生了时间依赖的阶梯状模式。此外，AsCas12f1 具有靶标激活的 ssDNA 裂解活性。
图 | AsCas12f1 核酸酶的功能验证（来源：Nature Chemical Biology）
为了探索 CRISPRAsCas12f1 对基因组是否具有可编辑性，作者先后在细菌和人细胞做了基因编辑能力的验证。
图 | AsCas12f1 介导的细菌基因组编辑（来源：Nature Chemical Biology）
在 AsCas12f1 核酸酶介导的细菌基因组编辑中，作者引入了 lambda-red 重组酶来辅助同源定向修复（HDR），并补充了合成的单链供体寡核苷酸（ssODNs）作为修复模板，实验结果发现 AsCas12f1 删除了大肠杆菌中大小为 136bp 的 hisD 片段，从未破坏了组氨酸合成，导致大肠杆菌产生营养缺陷表型；同时，另一个大小为 236bp 的 cyaA 片段也被检测到删除，导致减缓了大肠杆菌的有氧生长。这些结果证明了 AsCas12f1 在体内基因组编辑方面的潜力。
图 | AsCas12f1 促进了人类细胞的基因组编辑（来源：Nature Chemical Biology）
紧接着，研究团队又在人源细胞系上作了编辑功能的验证。在 HEK293 细胞中，通过递送表达 NLs-AsCas12f1-NLs 的质粒及其 sgRNA 或 RNP，进行了内源性基因破坏实验。基于该质粒的基因破坏实验也能有效地应用于其他人源细胞系，如 HepG2 和 Huh-7。
为进一步验证 AsCas12f1 核酸酶是否能弥补 Cas9 等核酸酶的应用缺点，作者还将 hu6 驱动的 sgRNA 盒和巨细胞病毒（CMV）驱动的 NLS-AsCas12f1-NLS-P2A-EGFP 表达盒包装成单个 AAV 载体，并有效地将 CRISPR-AsCas12f1 系统转导到人类细胞（HEK293, U-2 OS,Huh-7）中，结果成功诱导了所有三种细胞系中 VEGFA 和 PDCD1 基因的缺失突变，最大编辑效率为 11.5%。
图 | AsCas12f1 的错配耐受性和全基因组编辑保真度（来源：Nature Chemical Biology）
此外，作者通过在 sgRNAs 的引导序列中插入 1- 或 2-nt 的错配来评估 AsCas12f1 介导的基因编辑的错配耐受性。而 1-或 2-nt 错配显著降低了 AsCas12f1 在内源性位点上的缺失突变活性，表明 AsCas12f1 表现出足够的编辑保真度。用 CIRCLE-seq 技术来识别 AsCas12f1 的脱靶切割事件，直接检测 AsCas12f1 核酸酶的全基因组切割活性。但结果发现了几处脱靶位点。
作者发现并证明了 AsCas12f1 是一种可编程 RNA 引导的 dsDNA 核酸酶，并在细菌和人类细胞中发挥一定的基因编辑作用。和常见的 Cas9 核酸酶介导的基因编辑相比，AsCas12f1 衍生的编辑可以被相同的引导 RNA 迭代靶向，直到目标位点被 HDR 或长序列删除所消除。因此，CRISPR-AsCas12f1 系统具有结构紧凑、最小 PAM 需求量、方便细胞递送、广泛的基因目标群等优势，使其成为潜在的CRISPR-Cas系统成员，为基因组编辑领域的一些挑战带来新的解决方案。
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